齊瑤

研究難點

病毒是一種個體微小、結構簡單、只含一種核酸（DNA或RNA）、必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型生物。而病毒侵染宿主細胞卻是一個非常復雜的過程，主要分為吸附（Attachment）、進入（Entry/Penetration）、復制（Replication）、大分子合成（Biosynthesis）、裝配（Assembly）、釋放（Release）等幾個階段，如圖1。

圖1.HIV病毒侵染人源細胞過程示意圖^[1]

如何從初始的吸附和進入階段進行干預阻斷，是病毒性疾病防治的切入點之一。以人類免疫缺陷病毒（HIV），也就是引發艾滋病的病原為例，它通過顆粒表面的包膜糖蛋白（Env）與免疫細胞表面的CD4分子、輔助受體互作，實現病毒與宿主細胞的融合、感染過程?？茖W家們曾運用BlaM（β-內酰胺酶分析：測量細胞群中病毒融合的技術）或細胞內病毒衣殼蛋白p24分析等多種方法對病毒的侵染過程進行檢測，但由于技術的限制，均不能直接實時監測病毒進入宿主細胞的動態融合過程^[2]。因此，在時間和空間上都具備高靈敏度的FLIM-FRET，成為了該項研究的破冰技術。

FLIM-FRET

經常關注徠卡課堂的同學們，想必對FLIM-FRET都不陌生了。在這里，我們再簡單回顧一下幾個關鍵性的概念。

熒光壽命：熒光是指熒光分子吸收能量后，其處于基態（S₀）的電子躍遷至激發態（S₁），經過短暫停留，由激發態（S₁）再回到基態（S₀）時釋放出光的現象，而熒光分子停留在激發態的時間就是熒光壽命（圖2A）。與熒光光譜一樣，熒光壽命也是熒光物質的一種內在*性質。

FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，熒光壽命成像）：是一種基于熒光壽命的顯微成像技術，其成像結果提供像素位點的壽命信息（如圖2B），使得我們在熒光強度成像之外，能更加深入地對樣品進行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強度成像的眾多優點，如不受熒光物質濃度、光漂白、激發光強度等因素的影響。但會因為分子構象、分子間相互作用、分子微環境、生理狀態等條件改變而發生變化，因此熒光壽命可用于分析分子的這些變化，基于熒光壽命測量的FRET是FLIM的重要應用之一。

圖2. A. 熒光壽命示意圖；B. FLIM：提供每個像素位點的熒光壽命信息（左）；基于熒光壽命信息的細胞成像結果（右）

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉移）：供體熒光基團（Donor）的發射光譜與受體熒光基團（Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當供體被激發后，且兩個熒光基團間的距離小于10nm時，處于激發態的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發，即發生熒光能量的非放射性轉移現象，為FRET（如圖3），這一過程也伴隨著供體熒光壽命的縮短和受體熒光壽命的延長。

圖3. FRET原理（左）^[2]及FRET實例（右）
（右）：用FLIM-FRET測量N1E-115 細胞膜上PH結構域的相互作用，發生FRET的細胞呈現較短的熒光壽命（偏綠），未發生FRET的細胞呈現較長的熒光壽命（偏紅）

FLIM-FRET兼具 FLIM 和 FRET 兩者的優勢，不受熒光物質濃度、光漂白、激發光強度等因素的影響，且樣品制備簡單，測量結果準確性高，易重復。因此，FLIM-FRET非常適合于進行分子間相互作用、分子構象或生理狀態改變等的研究。

應用實例

那么科學家是如何將FLIM-FRET應用于監測HIV病毒侵入宿主細胞的動態過程呢，讓我們看以下兩個實例：
（一）利用FRET生物傳感器示蹤HIV進入宿主細胞過程^[3]來自牛津大學的研究者設計了一個HIV-Chameleon生物傳感器，由一對能夠發生FRET的熒光團（mTFP1和eYFP）組成，兩個熒光團之間通過短肽序列（包含煙草蝕刻病毒TEV蛋白酶切割位點）鏈接在一起（如圖4A右）。TEV蛋白酶（TEVp）可以與HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合，摻入病毒顆粒中。當包含TEV蛋白酶的病毒與表達生物傳感器的細胞融合時，Vpr-TEV或Gag-TEV（rTEV）被釋放到細胞質中，并特異性地裂解鏈接序列，增加mTFP1與eYFP之間距離至10nm以上，阻斷FRET，并可通過FLIM進行測量。圖4B為FLIM偽彩圖與圖像中所有像素的壽命直方圖，其中藍色表示較短的壽命（無融合），紅色表示較長的壽命（融合）。這樣就可以實時定量熒光壽命的改變，從而示蹤病毒與宿主細胞融合的瞬間動態過程。作者將所得結果與廣泛使用的BlaM分析結果比對，二者具有高度匹配性，因此，HIV-Chameleon生物傳感器與FRET-FLIM的結合使用，可以實現單個活細胞或群體的病毒融合動力學實時監測。

圖4. HIV-Chameleon檢測病毒融合^[3]
A.（左）TEV蛋白酶（TEVp）與HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合的兩種包裝過程；（右）HIV-Chameleon生物傳感器示意圖；B.病毒融合前后的熒光壽命成像（Scale Bar=30μm）
 

（二）細胞代謝水平對于HIV-1侵染宿主細胞的影響^[4]研究人員在HIV-1病毒的侵染機制研究中發現，病毒侵染過程中，宿主細胞代謝水平與膜狀態改變有關。將FRET生物傳感器瞬時轉染到細胞中（如圖5A），記錄瞬時表達這些生物傳感器的細胞的FLIM圖像，并進行BlaM分析，結果表明，乳酸濃度較高的單細胞與病毒融合性更高，此外，具有更高ATP/ADP比率的細胞與病毒的融合性更高（如圖5B）。也就是說，糖酵解通量較高的細胞更容易被HIV-1感染。
 

圖5. 單個細胞中的相對乳酸濃度和ATP / ADP比率與HIV-1融合相關^[4]；
（A）FRET生物傳感器;（B）同樣區域細胞的BlaM（上）和FLIM成像（下），白色實線所示為正在與病毒融合的細胞，在BlaM中呈紅色，熒光壽命較長，白色虛線所示為未融合的細胞，BlaM中呈綠色，熒光壽命較短

進一步的分析表明，2-脫氧-d-葡萄糖（2-DG）對糖酵解的靶向抑制作用大大降低了HIV-1的融合和感染。而用2-DG處理的細胞分別具有較低的膜膽固醇和較高的膜張力值。因此，作者構建了一種基于Ypet/eCFP FRET的膜張力感應器MSS，由一個彈性張力傳感模塊和兩個與脂分子連接的蛋白質組成，這兩個蛋白質錨定在質膜的Raft和非Raft區域，對膜張力變化非常敏感（如圖6）。通過FLIM測量單個細胞MSS張力探針瞬時表達，證實了HIV-1需要在膜張力較低的區域進入細胞，也進一步確定了宿主細胞糖酵解活性和膜張力之間的聯系，其在活細胞中的單病毒融合水平上實時影響HIV-1融合。

圖6.（左）靈敏型膜張力感應器MSS探針以及對照組非靈敏型感應器KMSS探針示意圖；（右）多種不同處理條件下，TZM-bl 細胞表達MSS的FRET效率成像^[4]

總結

FLIM-FRET提供了基于群體方法或光譜方法所難以實現的單細胞微環境中的分辨率，能以高時空分辨率在單個細胞中可視化和識別影響HIV-1感染的關鍵因素，實現單一病毒跟蹤技術。這對于在HIV-1感染早期階段尋找艾滋病的治療方法，有著重要的科學意義。

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