樣本
IF方案存在于多種不同的樣本當中。簡單常用的方法是對細胞培養物中的培養（真核）細胞進行染色。貼壁生長的細胞可以接種在蓋玻片上，采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養皿上并在所需的時間用于IF檢查。IF還可在細胞涂抹于載玻片（例如細胞離心涂片）后用于懸浮細胞的檢查。在這兩種情況下，需重點分析細胞內的過程或結構，這被稱為免疫細胞化學（ICC）。

另一方面，在免疫組織化學（IHC）typo3/當中通過組織特定的環境聯系來檢查是否存在蛋白質或分子。此處器官制備的超薄切片（通常包埋在石蠟中）用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質的表達。

除了制備組織切片外，還可以對整個生物體進行IF檢查，這一過程被稱為“整體IHC”。為此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚等，或植物模型如擬南芥。在整體IHC中會受到試樣尺寸和相關IF試劑透化深度的限制。單獨的孵育步驟比培養細胞的染色要長。此外還必須提供帶有特殊光學設備的顯微鏡用于大樣本分析。

清洗步驟
在IF程序中應特別注意清洗步驟，因為適當的清洗可以提高IF質量。PBS是一種標準的清洗緩沖液，而PBS++或PBS-T等變體也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推測其具有防止細胞分離的膜穩定作用。對于PBS-T，添加最終濃度為0.05%的清潔劑Tween 20，目的是增加抗體的結合特異性。請務必注意小心地涂抹并吸取清洗緩沖液以免細胞從培養容器或蓋玻片上脫落。如有足夠的時間，請在吸取緩沖液時等待幾分鐘，以確保清洗緩沖液有效擴散到樣本中。IF程序的各個清洗步驟在下面的標準方案中列出。

傳統IF反應的各步驟描述如下。本文結尾附有常用的間接IF與培養細胞的標準程序。

固定
固定是IF程序的第一步。其目的是保持細胞、細胞結構或組織處于其當前狀態，并通過化學試劑長期保存。在固定過程中，重要的是細胞結構盡可能保持其原有的構象。不同的固定方法對IF有用，每種試劑對一抗表位有不同的影響。抗體結合位點可能被掩蓋或被固定所破壞，這會損害IF染色質量。由于每種抗體以不同的方式與抗原結合依賴于不同的固定化合物，因此有必要嘗試幾種新抗體的固定方法。

通常，合適的固定劑規格可以在抗體的數據表上找到。理想的固定應能夠保存細胞和亞細胞結構，并為良好的抗體結合暴露出抗原。實際上，您必須在兩者之間取得平衡。

固定試劑可以大致劃分成2組：化學交聯劑和有機溶劑。
化學交聯劑如通過游離氨基形成的福爾馬林交聯蛋白；細胞形態在大多數情況下保存良好。但抗原也可能發生交聯，進而可能減少抗體結合。戊二醛對細胞結構也有保存固定作用，但會導致顯微鏡下觀察到樣本有很強的自發熒光（見‘對照’章節）。

有機溶劑如甲醇或丙酮等具有脫氫作用并沉淀蛋白質，從而將其固定在細胞環境中。但切記，在該過程中可溶性分子和許多脂質成分都會丟失。通常將甲醇和丙酮組合使用，因為盡管甲醇適合保存細胞結構，但它對許多表位有極其不利的影響，而丙酮卻破壞性較小。除此還應該考慮到已經存在于細胞中的熒光蛋白（如GFP），會因被有機溶劑固定而在很大程度上被破壞。如果一抗的制造商未建議使用何種固定劑，則用4%福爾馬林在室溫下處理10分鐘即可用于各種細胞系和抗原。

透化
通過透化處理，抗體可以進入細胞內結構，否則抗體就無法通過細胞的脂膜。根據固定類型，有時需要單獨的透化處理。當用有機溶劑固定時，細胞膜已經具有滲透性，您可以直接進入封閉步驟。用化學交聯劑固定的細胞需要用清潔劑進行額外處理以實現透化。使用Triton X-100或NP-40等傳統清潔劑，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。同樣，根據應用的物質、濃度和培養時間會得到不同的結果，因此實驗人員應該在開始時嘗試不同的參數。典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。

如果希望通過IF來分析脂質相關蛋白或膜蛋白，則應謹慎開展透化步驟（=脂質去除）。比較理想的選擇是皂甙，能選擇性去除質膜上的膽固醇，使細胞內的膜基本上完好無損。如果在抗體染色前忽略了透化處理（只能通過化學交聯劑固定），則可以專門標記細胞外質膜結合抗原，以便將其與胞內抗原分開來。核酸染料如DAPI或Hoechst（見‘細胞核染色和樣本封固’章節）具有膜滲透性，因此不需要透化處理。

封閉
封閉是在細胞內最大限度降低一抗非特異性結合的重要步驟。為了實現這一點，可以使用來自牛血清白蛋白（BSA）、奶粉或血清的蛋白質。關鍵在于，這些封閉蛋白質并不源于產生一抗的物種，否則二抗對于一抗的特異性就會損失。如果您使用的是二抗，如山羊產生的抗小鼠一抗，則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。通常使用濃度為1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封閉溶液，并在清洗緩沖液中稀釋。在室溫下孵育30-60分鐘。

免疫反應
經固定、透化和封閉制備樣本后，會開始進行免疫反應。樣本現在與特定的一抗一起孵育，以標記所需的靶結構。幾種一抗可同時應用于樣本。如上所述，在間接多色IF中，幾種一抗必須來源于不同的物種。首先根據制造商的要求，在選定的封閉溶液中進行抗體稀釋。如果對染色不滿意，或者如果制造商沒有提供任何有關有效稀釋的信息，您應該嘗試使濃度保持在1:50到1:1000之間。根據抗體的親和力，孵育時間可能會有所不同。默認培育時間為室溫下1-2小時；也可以在4℃下過夜。

如果選擇直接IF，則可在一抗孵育后直接進行封片，因為一抗已經帶有熒光色素。在間接IF當中，二抗現在已經對一抗進行了熒光標記。這里的關鍵點在于使用一抗進行孵育后要進行充分清洗，以減少二抗的非特異性結合。二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進行稀釋。如果制造商沒有不同的指示，可以從1:200的稀釋開始，在室溫下孵育1小時。有必要避光培養以防出現熒光色素漂白。

細胞核染色與樣本封片
免疫反應之后通常是用DNA染料對細胞核染色。另一方面，在用顯微鏡觀察時這種處理可以更好地在細胞或組織切片內進行定向，同時還可以指示出細胞狀態（如有絲分裂）是否為研究所需的狀態。即便在沒有透化的情況下也能進入到細胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。有鑒于此，實驗人員應當十分小心，避免這些染料直接與皮膚接觸！室溫下簡單的細胞染色耗時大約10分鐘，期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。

完成IF步驟后，樣本必須適當封片以便于開展顯微鏡檢查。有鑒于此，需要使用封固介質（如Mowiol或Prolong Gold）來將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。另外，封固介質增加了折射率，有利于使用油浸物鏡進行顯微鏡檢查。一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質，如DABCO，這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。根據使用的熒光色素，一些抗褪色劑比其他的更有效。

此外，還可使用添加了DNA染料的封固介質以便在包埋期間對細胞核進行染色，就無需進行單獨的細胞核染色。如果使用硬化封固介質（通常情況下），則允許樣本過夜固化，因此可以在第二天進行顯微鏡檢查。以這種方式生產的玻片幾乎可以長時間儲存在室溫或4℃的黑暗環境中，但請記住，熒光色素的熒光強度會隨著時間的推移而減弱。

對照
免疫熒光必須進行適當對照，以正確顯示顯微鏡圖像。缺少或不適合的對照通常會導致假陽性結論和不正確的數據。首先應當分析只被固定、透化和封閉的樣本以便了解細胞間室的自發熒光typo3/。有時即使沒有進行IF染色，結構也可能出現強熒光信號。

為了進一步的對照和調整間接IF的顯微鏡參數，使用已采用上述方法進行處理過的樣本，但樣本還要額外使用二抗進行孵育。首先將揭示二抗與樣本的強非特異性結合。其次，設置顯微鏡參數以便在該對照的圖像采集期間不記錄任何信號。此設置用作后續采集的閾值來排除二抗的假陽性信號。在直接IF當中，自體熒光對照用于調節閾值。接下來分析與特異性一抗一起孵育的樣本，如果是間接IF，也分析與二抗一起孵育的樣本。此時應可檢測到熒光信號，其高于自發熒光和二抗的陰性對照。

為了確保一抗特異性標記所需結構，一些制造商為一抗提供遮蔽特定抗原的肽封閉，從而防止抗體與其表位結合。如此處理成本高昂，但也是確定抗體特異性的最佳方法，因此得到可靠的結果。

在多色IF實驗中還必須注意所選熒光色素之間的串擾。如果是第一次進行多色IF檢查，建議在單獨的制備中另外染色靶向結構，并將這些圖像與多色圖像進行比較。最后應該仔細查看所獲得的數據并將其與您的期望和一抗的現有數據進行比較。

局限性
如前所述，IF檢查有諸多優勢，但同樣也存在著一定的劣勢。關鍵點是樣本的固定：固定意味著滅活，因此活細胞成像已變得不再可能。因此對動態過程的分析會比較復雜，每個時間點上的細胞都必須予以固定和染色。所以快速動態過程無法通過IF來進行觀察。這顯然是融合蛋白表達熒光標記如GFP（綠色熒光蛋白）的優勢，比較適合用于活細胞成像。

如上所述，IF實驗過程中（固定/透化）會改變細胞結構，因此偽影可解釋為假陽性信號。所以有必要為每個IF染色準備適當的對照品，可能很費時。另一個缺點同樣不可避免：熒光染料的光漂白。像GFP這樣的熒光蛋白也受此影響，但當儲存在適當的條件下，即使在幾個月的制備后，GFP也能被檢測到。相反，IF熒光色素的強度損失更快，這反映在顯微鏡下樣本的快速漂白。即使是用抗褪色劑封固介質也只能暫時起作用。

標準IF流程
IF實驗所需時間：約5個小時。
這是一種蓋玻片上通過化學交聯劑進行固定的培育細胞接受間接IF檢查的標準方案。

· 濕盒非常適合IF實驗，并且可以輕松完成自制（見幻燈片“如何制備濕盒”）。該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進行培養，這對于處理熒光色素很重要，并且對于已經存在的熒光蛋白是必要的。
· 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠*濕潤。確保樣本絕對不會*干燥。
· 所有培育步驟都在室溫下完成。
1. 清洗細胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉細胞的蓋玻片放入濕盒。
2. 使用4% 福爾馬林進行10分鐘的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS進行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進行45分鐘的封閉（無需清洗）。
5. 在封閉溶液內稀釋一抗并使用2小時（或在4℃下連夜使用）。清洗4次將未結合的一抗*清除掉。
6. 使用二抗進行1個小時的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內進行稀釋。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS當中孵育10分鐘。*清洗4次，即便此時還沒有出現細胞核染色。
8. 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其進入H2O內，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
9. 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細胞倒置這滴溶液上。用鑷子輕輕按壓試樣，使封固介質均勻分布而不會擠壓樣本。
10.固化后就準備好進行顯微鏡觀察了。

配方
清洗緩沖液
· 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4

· 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4
· 如為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20

固定緩沖液
· 福爾馬林：
1. 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O當中，pH值8（使用NaOH進行調節）。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4。

· 甲醇（預先冷凍至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）

· 甲醇/丙酮（預先冷凍至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）

· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，最終濃度0.1% TX-100

· 皂甙：
1. PBS，最終濃度0.1%的皂甙

· 其他清潔劑可在PBS當中以相同濃度進行使用。

封閉緩沖液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，最終濃度為1% BSA

· 奶粉：
1. PBS，最終濃度為1%奶粉

· 正常血清：
1. PBS，最終濃度為5%正常血清

細胞核染料
· Hoechst或DAPI：
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。