免疫系統(tǒng)對癌癥治療的反應(yīng)可以反映患者在治療之后是否會有良好的結(jié)果。了解腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤發(fā)生和治療反應(yīng)中的變化對制定個性化的治療方案并改善癌癥治療至關(guān)重要。借助穩(wěn)定和全面的超多標(biāo)成像技術(shù)，可使用免疫標(biāo)志物探查髓系和淋巴系細(xì)胞的譜系和結(jié)構(gòu)，而且結(jié)合特定腫瘤生物標(biāo)志物時，還可以捕捉多種腫瘤中TME內(nèi)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞類型特征模式，結(jié)合超多標(biāo)組織成像的探查能力，可以針對免疫細(xì)胞群和TME內(nèi)眾多類型細(xì)胞的空間相互作用提供之前無法獲得的全新認(rèn)識。

Cell DIVE超多標(biāo)成像分析整體解決方案可以使用循環(huán)染色和染料失活流程對一個完整組織切片上的數(shù)十個生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測和成像。Cell DIVE的核心是一個精確、靈活、開放的多標(biāo)記成像解決方案，可以靈活選擇多標(biāo)記成像研究中常用的生物標(biāo)志物抗體。Cell Signaling Technology(CST)擁有豐富的經(jīng)IHC驗證的抗體組合，可檢測TME中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，實現(xiàn)組織中的免疫細(xì)胞檢測和表型判斷。CST提供抗體偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物均經(jīng)過驗證，可用于Cell DIVE上，并提供經(jīng)IHC驗證抗體與熒光團(tuán)和其他檢測試劑的定制化偶聯(lián)。CST采用嚴(yán)格的IHC驗證方法，隨后還會在Cell DIVE平臺上進(jìn)行驗證，可確保成功檢測蛋白質(zhì)。

在本研究中，我們展示了使用由數(shù)十種CST生物標(biāo)志物抗體^™組成的新型檢測模式，在多種組織類型中進(jìn)行的Cell DIVE超多標(biāo)成像。多標(biāo)記檢測模式的開發(fā)所需的優(yōu)化極少，可識別復(fù)雜的細(xì)胞類型，并揭示腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間相互作用。

表征腫瘤微環(huán)境有助于理解導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的新機(jī)制。腫瘤微環(huán)境比較復(fù)雜，通常在單個樣本和不同患者樣本中都是異質(zhì)的。循環(huán)多標(biāo)記染色和成像可在不同組織樣本中實現(xiàn)TME探查，即使可用組織有限的情況下。在這項研究中，我們檢查了12個完整組織或TMA切片中30多個生物標(biāo)志物的表達(dá)（表1），重點是潛在的免疫治療目標(biāo)、預(yù)測性生物標(biāo)志物和分割標(biāo)志物。所有的CST生物標(biāo)志物抗體均被連接并隨機(jī)分配到一個回合。

為了在TME中其他細(xì)胞的背景下定義免疫細(xì)胞，融合并分割了所有的生物標(biāo)志物圖像，并使用聚類分析和降維（UMAP）對表達(dá)進(jìn)行分析。聚類分析提供了一個無偏見的方法來定義組織內(nèi)的免疫細(xì)胞貢獻(xiàn)。

在這項研究中，我們展示了人類結(jié)腸腺癌（CAC；圖1）的聚類分析。在這里，聚類分析將白細(xì)胞從所有其他上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類型中區(qū)分出來（圖1C）。此外，聚類清楚地定義了淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞類別。CAC中的骨髓類亞型包括骨髓祖細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和另外兩個未知亞型的骨髓聚類。其他生物標(biāo)志物可用于進(jìn)一步定義亞型。對于淋巴類，定義了T細(xì)胞和NKT細(xì)胞聚類。另外，還確定了一個具有CD20陽性的T細(xì)胞聚類。使用機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行單細(xì)胞表型分析，可以從聚類中進(jìn)一步定義細(xì)胞類型。例如，在圖像1D中，聚類15中的一個細(xì)胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（圖1D-E；橙色圈）。聚類和單細(xì)胞空間分析被應(yīng)用于研究中的所有其他組織（圖2；數(shù)據(jù)未顯示）。

CST抗體經(jīng)過了嚴(yán)格的驗證，以確保抗體在FFPE組織上的表現(xiàn)。本研究中的所有抗體都是直接偶聯(lián)或商業(yè)偶聯(lián)物成品（表1）。偶聯(lián)是使用非位點特異性化學(xué)方法進(jìn)行的。抗體與四種不同的染料過量偶聯(lián)，去除未結(jié)合的染料，并通過分光光度分析測量標(biāo)記的程度。經(jīng)過初步驗證，具有*佳標(biāo)記程度和濃度的偶聯(lián)抗體溶液隨后用于對各種人類癌癥組織和正常組織的染色。組織從商業(yè)來源獲得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI對組織進(jìn)行成像，并自動進(jìn)行自發(fā)熒光去除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開發(fā)的zhuanli軟件全拼接圖像進(jìn)行導(dǎo)入、融合和分析。