生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熒光顯微鏡通常關(guān)注一系列不同顏色發(fā)射的相關(guān)性。不同的顏色代表特定染色的結(jié)構(gòu)或代謝參數(shù)。生物學(xué)是研究生物體的科學(xué)，而生物體即使在微觀尺度上也在運(yùn)動(dòng)。這一事實(shí)不僅適用于快速移動(dòng)的原生動(dòng)物，也適用于被認(rèn)為是靜態(tài)的個(gè)體，如植物。細(xì)胞區(qū)室、蛋白質(zhì)和代謝分子通常用不同顏色的熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。多光子顯微鏡增加了其他選項(xiàng)，如二次和三次諧波生成。這些顏色通道最好是同時(shí)記錄，即并行記錄，以保持它們?cè)诟叨葎?dòng)態(tài)變化的環(huán)境中的相關(guān)性。通過(guò)這種方式，同時(shí)記錄保留了被研究生物參數(shù)之間的時(shí)間和空間相互關(guān)系，并且提高了時(shí)間分辨率。這需要多個(gè)光傳感器用于不同的顏色通道，這些傳感器并行工作，并同時(shí)提供相關(guān)光譜的光的分?jǐn)?shù)。

替代方案是順序記錄，其中為不同的光譜分?jǐn)?shù)提供一個(gè)單一傳感器，依次記錄每個(gè)分?jǐn)?shù)的圖像并隨后疊加。使用順序方法，不僅可能會(huì)喪失空間和時(shí)間的相關(guān)性，而且時(shí)間分辨率也降低，降低的幅度至少等于記錄參數(shù)的數(shù)量。因此，整個(gè)數(shù)據(jù)采集所需的時(shí)間要長(zhǎng)得多：按相同的比例。

同時(shí)記錄光譜發(fā)射分?jǐn)?shù)的經(jīng)典解決方案是使用二色光束分割鏡和阻擋濾光片的排列。這種設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)是，對(duì)于更改的染料組合，系統(tǒng)必須提供適當(dāng)?shù)臑V光配置，使其成為一種成本高、速度慢且不靈活的解決方案。

對(duì)于單通道系統(tǒng)，這種不靈活性通過(guò)使用光譜設(shè)備——光譜儀被消除了。1997 年，徠卡激光技術(shù)公司推出了第一款具有自由可調(diào)檢測(cè)通道的多通道光譜設(shè)備，允許共聚焦顯微鏡同時(shí)記錄不同顏色的圖像：SP 探測(cè)器。^[1]

該 SP 探測(cè)器解決方案用于共聚焦顯微鏡，采用一個(gè)棱鏡將檢測(cè)光分成其光譜成分，并通過(guò)一組級(jí)聯(lián)光譜儀狹縫將可調(diào)帶傳遞到傳感器。電動(dòng)屏障由反射鏡制成，因此可以將互補(bǔ)部分進(jìn)一步引導(dǎo)到傳感器上。通過(guò)這種方式，完整的光譜可以被切割成多個(gè)部分，每個(gè)部分可以進(jìn)行微調(diào)，以實(shí)現(xiàn)通道的最佳分離，而無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的計(jì)算。這個(gè)概念依賴(lài)于共聚焦顯微鏡中發(fā)射光束是靜止的這一事實(shí)。掃描運(yùn)動(dòng)通過(guò)掃描鏡進(jìn)行補(bǔ)償，發(fā)射的光以相反的方向經(jīng)過(guò)這些鏡子。然后，靜止的光束通過(guò)檢測(cè)針孔，生成光學(xué)切片。

然而，在多光子顯微鏡中，光學(xué)切片是通過(guò)光子的非線(xiàn)性相互作用產(chǎn)生的，這種相互作用在焦平面上具有足夠的密度。因此，不需要針孔，發(fā)射的光可以在通過(guò)掃描設(shè)備之前被檢測(cè)到，即非掃描檢測(cè)。這種方法對(duì)于成像深處的渾濁物體（如許多生物樣本）尤其重要，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出顯著的散射，導(dǎo)致光子損失。使用非掃描探測(cè)器，收集效率大大提高，圖像更加清晰，研究人員可以更深入地觀察標(biāo)本。然而，這一概念沒(méi)有靜態(tài)光束，這導(dǎo)致光譜在棱鏡和光譜儀狹縫上晃動(dòng)，從而導(dǎo)致位置依賴(lài)的光譜響應(yīng)。

在瞳孔平面（參見(jiàn)圖 3 中的 P），它與顯微鏡物鏡的后焦平面重合，位置是固定的，但角度隨著掃描過(guò)程不斷變化。這個(gè)關(guān)系被用來(lái)方便地掃描樣本，而不需要移動(dòng)標(biāo)本或光源。掃描鏡被放置在與后焦平面共軛的平面中。當(dāng)掃描時(shí)，鏡子改變光束角度，這會(huì)導(dǎo)致焦平面中的位置變化。

在任何像 G 這樣的平面中，位于 F 和 P 之間，角度和位置都隨著掃描而變化。

如果我們將梯度濾光片放置在與場(chǎng)共軛的平面中，那么由于變化的位置我們將會(huì)有顏色變化。在與瞳孔共軛的平面中，由于變化的角度我們將會(huì)有顏色變化。

但是，如果我們將濾光器放在一個(gè)合適的位置（圖 3 中的位置 G），并且如果我們合理設(shè)計(jì)濾光器涂層，那么我們可以使這兩種效果相互抵消 ^[2]。光束路徑和濾光器的設(shè)計(jì)計(jì)算有些繁瑣，但最終會(huì)得到一個(gè)實(shí)用的解決方案。這些結(jié)果是通過(guò)徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測(cè)器實(shí)現(xiàn)的。

圖 6： 使用 4Tune 探測(cè)器的多光子顯微鏡拍攝的鼠皮膚切片圖像。Lgr5CreERT2-GFP 彩色斑點(diǎn)小鼠的小腸。灰色：SHG 信號(hào)（膠原蛋白 1），綠色：Lgr5+干細(xì)胞。紅色、藍(lán)色和黃色，追蹤的細(xì)胞是 Lgr5 干細(xì)胞的后代。樣本由荷蘭烏特勒支的 Jacco van Rheenen 提供。