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光學(xué)顯微鏡通常是生命科學(xué)研究實驗室中的核心設(shè)備之一。它可以用于各種應(yīng)用，揭示許多科學(xué)問題。因此，顯微鏡的配置和特征對其應(yīng)用范圍至關(guān)重要，從明場顯微鏡到熒光顯微鏡，再到活細胞成像。
本文提供了相關(guān)顯微鏡特征的簡要概述，并總結(jié)了選擇科研級顯微鏡時應(yīng)考慮的關(guān)鍵問題。
你使用什么樣的標(biāo)本？
選擇科研級顯微鏡時要考慮的首要事項之一是你想要探索的標(biāo)本類型。對于固定在薄玻璃載玻片上的樣本，可以使用立式顯微鏡。活細胞對顯微鏡有特殊要求，因為它們被放置在相對較大的細胞培養(yǎng)容器中，里面裝有細胞培養(yǎng)基。
圖 1：左：用于安裝固定樣本（例如組織切片）的玻璃載玻片。右：用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)皿。
只有倒置配置，即物鏡在標(biāo)本下方，冷凝器在標(biāo)本上方，才能提供必要的自由空間和物鏡與標(biāo)本的所需接近度。同時，倒置顯微鏡保持了對細胞的良好可及性，例如添加微操縱器。
此外，活細胞需要適當(dāng)?shù)沫h(huán)境才能生存。溫度和 CO2 濃度必須保持在一定水平。一個氣候箱及相應(yīng)的控制器是完成此任務(wù)所必需的。
圖 2：左：直立顯微鏡的物鏡在標(biāo)本上方，冷凝器在標(biāo)本下方。右：在倒置顯微鏡中，這種設(shè)置被反轉(zhuǎn)，給用戶提供了更多空間以及物鏡與標(biāo)本的所需接近度。
你認為在什么維度上？
顯微鏡標(biāo)本擴展到三個維度：長度、寬度和高度。雖然一些標(biāo)本，如組織切片，僅在 xy 方向成像，但還有其他應(yīng)用需要在 z 維度上進行采集。為了成像例如活細胞的 3D 體積，建議使用能夠逐步引導(dǎo)樣本通過焦點的電動物鏡轉(zhuǎn)盤。成像軟件應(yīng)能夠重建單個圖像以進行 3D 可視化。
對于活細胞，您必須添加時間維度。在這種情況下，例如系統(tǒng) 穩(wěn)定性 是另一個關(guān)鍵特征。由于溫度變化會影響成像系統(tǒng)在采集過程中的表現(xiàn)，因此有效的對策至關(guān)重要。自動對焦調(diào)整，例如 自適應(yīng)焦點控制 (AFC)，可以抵消這些熱影響，并始終找到預(yù)定義的焦點。
圖 3：自適應(yīng)焦點控制（AFC）在長期時間延遲采集過程中自動穩(wěn)定顯微鏡的焦點。傳感器檢測 LED 光束（850 nm）的移動，當(dāng)承載樣本的蓋玻片因熱活動等原因改變位置時，會發(fā)生這種移動。
哪種對比方法會適合您的樣本？
大多數(shù)細胞——尤其是動物細胞——在顯微鏡下觀察時沒有足夠的內(nèi)在對比度來看到細節(jié)。研究人員使用 對比方法 來解決這個問題。雖然相位對比 (PH) 和差分干涉對比 (DIC) 操控通過標(biāo)本的光線以增加對比度，但您也可以用熒光染料 （如何準(zhǔn)備您的標(biāo)本以進行免疫熒光顯微鏡觀察）進行染色，或者使用熒光蛋白。
根據(jù)對比方法，顯微鏡需要特定的設(shè)備；例如，相位對比需要特殊的物鏡，而 DIC 則利用某些 棱鏡，這些棱鏡必須切換到光路中。對于熒光顯微鏡，您需要特殊的濾光塊，以允許正確的光波長進入和離開標(biāo)本。
圖 4：采用不同對比方法獲得的一系列神經(jīng)細胞。從左到右：明場，DIC，相位對比，熒光
光源怎么樣呢？
對比方法的選擇也決定了光源。傳統(tǒng)明場顯微鏡、相位對比和 DIC 的透射光照明可以使用 鹵素或 LED 照明。熒光顯微鏡可以使用 LED 照明或借助 汞、氙或汞金屬鹵化物燈進行。
你想記錄或發(fā)布你的結(jié)果嗎？
如果你想拍攝你的標(biāo)本或進行活細胞成像，你需要一個數(shù)字顯微鏡相機。特別是在熒光活細胞成像的情況下，建議使用靈敏的相機，以最小化可能對細胞造成傷害的激發(fā)光量。除了成熟的CCD和EMDDC相機外，如今 sCMOS 相機因其高量子效率和采集速度而受到歡迎。有關(guān)數(shù)字顯微鏡相機的更多信息，請閱讀文章《數(shù)字相機技術(shù)簡介》。
此外，較大的 視野 (FOV) 有助于更快地找到有趣的區(qū)域，并同時成像更多的細胞。現(xiàn)代研究顯微鏡在相機端口配備了 19 毫米視野，與 19 毫米 sCMOS 相機芯片匹配。
19 毫米視場的優(yōu)勢
通常，僅僅拍攝樣本的圖像是不夠的，還需要對您獲得的數(shù)據(jù)進行分析。為此，易于使用的 成像和分析軟件 有助于獲取定量數(shù)據(jù)并進行可靠的數(shù)據(jù)分析。
你需要來自厚樣本的（3D）信息嗎？
厚樣本對顯微鏡觀察來說是一個挑戰(zhàn)。尤其是在寬場顯微鏡中，整個樣本同時被照明，識別處于焦點的樣本特征可能會因來自失焦區(qū)域的額外光線而顯著降低。
Computational Clearing可以幫助獲得不受失焦光影響的圖像。該技術(shù)可以應(yīng)用于單個圖像平面以獲得即時結(jié)果（ICC：即時Computational Clearing），或者可以與額外的去卷積步驟結(jié)合使用（SVCC：小體積Computational Clearing；LVCC：大體積Computational Clearing），以獲得更好的結(jié)果。去卷積將光子信息重新分配到其來源，從而提供更好的焦平面中所需結(jié)構(gòu)的對比度。這可以使用戶更容易區(qū)分感興趣的結(jié)構(gòu)與背景，而不是使用傳統(tǒng)的寬場圖像。
圖 5：癌組織中的單分子 RNA-FISH。RNA-01（綠色），RNA-02（品紅色）左：原始數(shù)據(jù)。中：使用即時Computational Clearing。右：經(jīng)過大體積Computational Clearing處理。瑞士蘇黎世大學(xué)安德烈亞斯·摩爾教授提供。
你想在顯微鏡下操作細胞嗎？
在過去幾年中，樣本的照片處理變得流行。這意味著研究人員不僅觀察活細胞，還借助光來操控它們。光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP）就是一個有助于理清動態(tài)細胞過程的例子。對于這些操控技術(shù)，通常需要額外的光源，這些光源必須集成到顯微鏡的光路中。
這種方法并不簡單。徠卡無限端口是一種通用解決方案，可以將額外的光源耦合到顯微鏡的光路中，而不影響圖像質(zhì)量，以進行例如 FRAP、光切換、消融或光遺傳學(xué)。只要有合適的適配器，研究人員甚至可以耦合他們自制的設(shè)備。
圖 6：徠卡 WF FRAP模塊（左側(cè)的黑箱）可以通過無限端口與倒置研究顯微鏡徠卡 DMi8 連接。
你的預(yù)算是多少？
一個重要的問題是你能花多少錢。一些顯微鏡供應(yīng)商提供適合特定應(yīng)用的預(yù)定義配置。但是，如果你不需要你所支付的所有預(yù)配置組件呢？這就是為什么自由配置的組件可能比購買預(yù)定義顯微鏡系統(tǒng)更便宜。
此外，顯微鏡的要求可能會隨著時間而變化。在這種情況下，可升級系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。使用預(yù)定義和固定配置，你可能會發(fā)現(xiàn)自己被限制在有限的應(yīng)用范圍內(nèi)。可升級性讓你有自由隨著需求的變化而成長。
考慮到這些因素，像徠卡顯微系統(tǒng)DMi8 這樣的模塊化顯微鏡平臺使研究人員能夠從一個負擔(dān)得起的顯微鏡系統(tǒng)開始，之后可以進行升級，以滿足他的需求
圖 7：得益于其模塊化設(shè)計，徠卡 DMi8 可以根據(jù)研究人員的需求進行配置。此外，如果需求發(fā)生變化，它還可以在后期進行升級。
誰會使用顯微鏡？
顯微鏡用戶的范圍可以非常不均勻。尤其在大學(xué)，用戶可能非常有經(jīng)驗或是初學(xué)者。因此，使用由直觀軟件驅(qū)動的易用顯微鏡系統(tǒng)，例如徠卡顯微系統(tǒng)應(yīng)用套件 X（LAS X），有助于快速入門并迅速獲取數(shù)據(jù)。例如，面向工作流程的設(shè)計、圖像分析向?qū)б约巴庠O(shè)的無縫集成簡化了您的工作。
除了寬場科研級顯微鏡，體視顯微鏡在生命科學(xué)研究實驗室中也經(jīng)常使用。有關(guān)更多信息，請參閱文章“選擇體視顯微鏡時需要考慮的因素"。
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