徠卡顯微系統 王浩甲

熒光顯微成像技術對生命科學的研究起到了巨大的推進作用，但自發熒光信號往往會對成像結果造成非常大的干擾（圖1）。常規的解決方法主要是通過改進制樣流程和調節成像參數來進行優化，但這些方法只能起到部分的改善作用，并不能*去除自發熒光信號。對于這個實驗路上的絆腳石難道真的就沒有辦法了嗎？當然不是，接下來就為您介紹自發熒光的克星——熒光壽命。

圖1.鈴蘭莖自發熒光

 熒光分子受到特定激光激發后，從基態躍遷到激發態，再以輻射躍遷的形式發出熒光并回到基態，熒光分子停留在激發態的時間就叫做熒光壽命（圖2）。如果自發熒光和我們用來標記樣本的熒光基團的壽命存在較大的差異，通過調節熒光壽命檢測范圍，就可以避免這些干擾信號的接收了。

圖2.熒光激發示意圖

 從激發光開始照射樣品到檢測器探測到光子的這段時間稱作“光子到達時間”。樣品的“熒光壽命”與“光子到達時間”呈正相關，而一個像素點中包含多個光子，多個光子到達時間的平均值（Average Arrival Time, AAT）就可以反映該像素點的熒光壽命信息。

徠卡全新推出的帶有白激光的STELLARIS系列激光共聚焦顯微鏡（圖3）配備了基于AAT檢測技術的TauSense模塊，它包含三大項功能，對您的實驗大有裨益，大家一起來認識一下吧！

 圖3. STELLARIS

• TauGating

獲得高質量的熒光圖像是成像實驗基本的需求，但背景噪音、自發熒光、反射光、雜散光等等頑固分子一次次地挑戰著我們的耐心，而使用TauGating即可一鍵式去除這些干擾因素。

TauGating操作非常簡單，如圖4，點擊“+”或“-”即可靈活修改通道數，可設置多達16個通道，每個通道的時間檢測范圍均可獨立調節。一般來說，上述干擾因素的AAT和熒光信號的AAT存在差異，通過調節時間檢測范圍即可避開對干擾因素的接收，獲得真實的熒光信號。

圖4. TauGating操作界面

從圖5可以看到，和常規共聚焦成像相比，TauGating消除了背景雜散光，圖像的對比度和信噪比得到了極大的提升。

圖5. TauGating與常規共聚焦成像效果對比

• TauSeparation

在實驗設計階段，熒光基團的選擇是一件非常重要且復雜的事情，不僅要考慮到各種繁雜的光譜組合來避免通道之間的串色，還要考慮使用和共聚焦固定激發譜線相匹配的染料。如此一來，留給我們的選擇往往就會很少，如果樣本中有自發熒光，染料選擇就更加受限了。針對這項問題，TauSeparation可以為您提供*的解決方案。

圖6. NE-115細胞4色熒光成像

多色染料拆分

圖6中，NE-115細胞同時標記了LifeAct-mNeonGreen、Mitotracker Green、 NuC Red 和 SiR-tubulin共4種熒光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和 Mitotracker Green的發射光譜高度重疊，NuC Red和 SiR-tubulin的發射光譜高度重疊，所以在用常規共聚焦（左圖）拍攝時只能體現出兩種信號的差異。而在TauSeparation模式下（右圖），通過檢測AAT，我們使用一個檢測器就可以同時將這兩種發射光譜重疊的染料區分出來（LifeAct-mNeonGreen-紅色，Mitotracker Green-綠色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品紅色），所以只需要使用兩個檢測器，就可以得到這幅沒有串色的4色熒光圖像了。

圖7. 植物組織自發熒光檢測

自發熒光拆分

對于自發熒光的拆分，TauSeparation同樣得心應手。例如圖7左側的常規熒光強度圖像，熒光信號和背景自發熒光沒有區別；右側的圖像在TauSeparation模式下，葉綠體中的自發熒光（藍色）與來自細胞膜的目標熒光信號（綠色）就可以非常清楚地區分開了，是不是很簡便呢？

• TauContrast

當您選擇在TauContrast模式下成像時，不但可以獲取常規的熒光強度圖像，還可以通過AAT獲取分子的代謝狀態、pH值和離子濃度等功能信息，充分挖掘出樣本潛在信息。例如圖8中Ca²⁺濃度會影響熒光基團Oregon Green 的熒光壽命，通過TauContrast可以實時獲取Oregon Green的AAT，從而反映各框選區域（ROI）的Ca²⁺濃度隨時間的變化水平。

圖8. 機械刺激后對標記了Oregon Green 488的哺乳動物細胞鈣振蕩進行檢測。在TauContrast模式下通過檢測AAT的變化來記錄單個細胞對機械刺激的響應情況。以4.5fps的拍攝速率記錄了AAT在不同框選區域的變化軌跡（用不同顏色選擇的ROI）。圖像尺寸：256 × 256 pixels；Rainbow LUT (TauContrast): 0-4 ns.

通過白激光和AOBS，徠卡*實現了激發光選擇自由；

通過棱鏡分光和狹縫檢測技術，徠卡*實現了所有檢測器的全光譜檢測自由；

這一次，通過TauSense技術，不僅*排除了自發熒光干擾，染料選擇也更加自由。

沒有自發熒光的干擾，全流程的選擇自由，讓您可以任意pick熒光染料和熒光蛋白，讓您的idea不再受到硬件設施的限制。STELLARIS能給您帶來的好處遠不止于此，歡迎您關注我們的公眾號，我們將持續為您帶來更多更詳盡的的講解。科研路漫漫，愿STELLARIS助您的科研之舟乘風破浪，揚帆遠航！